遺伝子障害を治療する方法

专利摘要:
ＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質をコードするアデノ随伴ウイルスベクターを、それを必要とする対象に投与することにより、ＭＹＯ７Ａ遺伝子またはＣＥＰ２９０遺伝子の変異に関連する疾患、特にＩＢ型アッシャー症候群およびレーバー先天性黒内障を治療するための方法；この方法に使用するための遺伝子構築物およびアデノ随伴ウイルスベクター。
公开号:JP2011516049A
申请号:JP2011502272
申请日:2009-03-30
公开日:2011-05-26
发明作者:アルベルト アウリッキオ、
申请人:フォンダジオーネ テレソンＦｏｎｄａｚｉｏｎｅ Ｔｅｌｅｔｈｏｎ；
IPC主号:C12N15-09

专利说明:

[0001] 本発明は、標的の網膜細胞においてＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質をコードするアデノ随伴ウイルスベクターを、それを必要とする対象に投与することにより、ＭＹＯ７ＡおよびＣＥＰ２９０遺伝子の変異に関連する感覚神経的な疾患、特にＩＢ型アッシャー症候群（ＵＳＨ）およびレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）を治療するための方法および組成物を提供する。本発明はまた、この方法に使用するための遺伝子構築物およびアデノ随伴ウイルスベクターを包含する。]
背景技術

[0002] レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）は、もともとＬｅｂｅｒ（１８６９）で報告されているが、他の網膜ジストロフィーとは異なる常染色体劣性疾患であり、先天性盲目の原因である。レーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）（ＭＩＭ２０４０００）は、視覚刺激に対する反応の悪さ、眼振および眼球彷徨を伴う、乳児期初期にあらわれる視覚機能の重度または完全な喪失によって特徴付けられる。罹患した個体は、網膜電図が消滅し、最終的には色素性網膜症を含めた眼底の異常を発症する。ＬＣＡは常染色体劣性の形質として遺伝する。視覚機能のない患者が生活に適応するのを助けること以外に治療法はない。]
[0003] 網膜色素変性症は、網膜の一連の遺伝的変性に対して付けられた名称である。アッシャー症候群は、網膜色素変性症のいくつかの形態のうちの１つであり、網膜変性および聴覚消失によって特徴付けられる。アッシャー症候群は、臨床所見によって主要な３つの型に分けられている。Ｉ型アッシャー症候群では、網膜色素変性症は前庭性運動失調および先天性重度難聴を伴い；ＩＩ型アッシャー症候群では、部分的な聴覚消失を有する網膜色素変性症があり；ＩＩＩ型アッシャー症候群では、網膜色素変性症および進行性の聴覚消失がある。ＩＩ型アッシャー症候群はほとんどの場合、染色体１ｑ４１上の遺伝子に起因する。ＩＩＩ型アッシャー症候群はほとんどの場合、染色体３ｑ２１−２４上の未特定の遺伝子に起因する。少なくとも６つの遺伝子（染色体１０ｑ、１１ｐ１５．１、１１ｑ１３．５、１４ｑ３２、２１ｑ２１上など）によってＩ型アッシャー症候群が引き起こされる可能性があり、その１つはミオシンＶＩＩａをコードする。３つのタイプのアッシャー症候群は併せて、１００，０００例あたり約５例の複合有病率を有し、これは、網膜色素変性症の全症例の約５〜１５パーセントに相当する。]
発明が解決しようとする課題

[0004] 本発明は、ＡＡＶ５カプシドを有する、ＭＹＯ７ＡまたはＣＥＰ２９０をコードするアデノ随伴ウイルスベクターを、好ましくは眼内に投与することにより、標的の細胞／組織（ＣＥＰ２９０については光受容体、ＭＹＯ７Ａについては網膜色素上皮に加えて光受容体）において機能的タンパク質が発現し、罹患した網膜が著しくかつ安定に形態学的にも機能的にも改善されるという知見に基づく。詳細には、アッシャーＩＢ（ｓｈａｋｅｒ Ｉマウス、Ｇｉｂｓｏｎ，Ｆ．ら、Ｓ.Ｄ.１９９５.「Ａ ｔｙｐｅ ＶＩＩ ｍｙｏｓｉｎ ｅｎｃｏｄｅｄ ｂｙ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｄｅａｆｎｅｓｓ ｇｅｎｅ ｓｈａｋｅｒ−１」，Ｎａｔｕｒｅ３７４：６２−６４）］）またはＣＥＰ２９０変異に起因するＬＣＡ（ｒｄ１２マウス、Ｃｈａｎｇ Ｂら、「Ｉｎ−ｆｒａｍｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｅｎｔｒｏｓｏｍａｌ／ｃｉｌｉａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＥＰ２９０／ＮＰＨＰ６ ｐｅｒｔｕｒｂｓ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈＲＰＧＲ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｄ１６ ｍｏｕｓｅ」，Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ.２００６ Ｊｕｎ １；１５(１１):１８４７−５７.Ｅｐｕｂ ２００６ Ａｐｒ ２１）の動物モデルにおいてｒＡＡＶ２／５−ＭＹＯ７ＡまたはｒＡＡＶ２／５−ＣＥＰ２９０を網膜下に送達することにより、光受容体およびＲＰＥ形態学（光受容細胞数、光受容体におけるロドプシン局在、ＲＰＥメラノソーム）および機能（網膜電図によって測定される網膜電気活性）が著しく改善されることが見出されている。]
[0005] これらの知見から、ＩＢ型アッシャー症候群（ＵＳＨ）およびレーバー先天性黒内障（ＬＣＡ）に対する有用な治療的アプローチが得られる。]
図面の簡単な説明

[0006] ＭＹＯ７ＡのｃＤＮＡを含むＡＡＶ血清型の平均力価（１ｍｌあたりのゲノムコピー数）を示す図である。
ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＭＹＯ７およびｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＣＥＰ２９０のゲノム完全性を示す図である。
ｒＡＡＶ２／５送達後のＭＹＯ７Ａの発現を示す。]
[0007] したがって、第一の態様では、本発明は、哺乳動物対象、特に、好ましくはＩＢ型アッシャー症候群およびレーバー先天性黒内障から選択される、ＭＹＯ７Ａ遺伝子またはＣＥＰ２９０遺伝子の変異に関連する疾患に罹患したヒト個体における網膜異常および／または網膜機能を改善するための方法に関し、本発明の方法は、
１）組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにＡＡＶ５カプシドを提供する工程であって、このベクターは、機能的なＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質をコードする核酸分子を含む発現カセットを担持し、この核酸分子は、その転写および翻訳を指示する調節制御エレメントに作動可能に連結されている工程と、
２）ＣＥＰ２９０をコードするベクターを光受容細胞に形質導入し、ＭＹＯ７Ａをコードするベクターを光受容細胞および網膜色素上皮細胞に形質導入することにより、この細胞内でＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質の発現を誘導する工程と
を対象とする。]
[0008] さらなる態様では、本発明は、哺乳動物対象、好ましくはＭＹＯ７Ａ遺伝子またはＣＥＰ２９０遺伝子の変異に関連する疾患に罹患したヒト個体における網膜異常および／または網膜機能不全の治療に使用するための、ＡＡＶ５カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、機能的なＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質をコードする核酸分子を含む発現カセットを担持し、この核酸分子はその転写および翻訳を指示する調節制御エレメントに作動可能に連結されている、ベクターに関する。]
[0009] 好ましい実施形態では、前記治療は、ＣＥＰ２９０をコードするベクターを光受容細胞に形質導入し、ＭＹＯ７Ａをコードするベクターを光受容細胞および網膜色素上皮細胞に形質導入することにより、この細胞内でＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質の発現を誘導することを包含する。別の好ましい実施形態では、ＭＹＯ７Ａ遺伝子またはＣＥＰ２９０遺伝子の変異に関連する疾患は、ＩＢ型アッシャー症候群およびレーバー先天性黒内障から選択される。]
[0010] 最大９ｋｂ、好ましくは約４．７〜９ｋｂのゲノムをパッケージすることができると証明されたＡＡＶカプシドを有するベクターは、他の血清型よりも効率的であり、したがって、このベクターを、本発明によるＭＹＯ７Ａ遺伝子またはＣＥＰ２９０遺伝子を送達するのに使用することが好ましい。網膜下腔に送達することにより、適切な分子量および生物学的活性を有する機能的なＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質が産生される組換えＡＡＶ２／５ベクターが特に好ましい。]
[0011] 「機能的なＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質」とは、ＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質が天然のタンパク質の機能を示すことを出願人は意味し、例えば、
−タンパク質ＭＹＯ７Ａは、光受容体および網膜色素上皮に正確に局在し、それにより光受容体におけるＲＰＥメラノソーム局在およびロドプシン局在が改善され、
−タンパク質ＣＥＰ２９０は、光受容体に正確に局在し、この発現によって光受容細胞喪失が阻害され、光受容体活性が増大する（網膜電図ＥＲＧによって測定される）。]
[0012] 好ましくは、機能的なＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質は、天然のタンパク質の機能の少なくとも５０％、より好ましくは少なくとも８０％、最も好ましくは少なくとも９０％を示す。ＭＹＯ７ＡおよびＣＥＰ２９０の機能的な活性の決定は、例えば、それぞれ参照により本明細書に援用されている、Ｈａｓｈｉｍｏｔｏ Ｔら、（「Ｌｅｎｔｉｖｉｒａｌ ｇｅｎｅ ｒｅｐｌａｃｅｍｅｎｔ ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ ｒｅｔｉｎａｓ ｉｎ ａ ｍｏｕｓｅ ｍｏｄｅｌ ｆｏｒ Ｕｓｈｅｒ ｓｙｎｄｒｏｍｅ ｔｙｐｅ １Ｂ」Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ.２００７ Ａｐｒ；１４(７):５８４−９４.Ｅｐｕｂ ２００７ Ｆｅｂ １）、およびＣｈａｎｇ Ｂら、（「Ｉｎ−ｆｒａｍｅ ｄｅｌｅｔｉｏｎ ｉｎ ａ ｎｏｖｅｌ ｃｅｎｔｒｏｓｏｍａｌ／ｃｉｌｉａｒｙ ｐｒｏｔｅｉｎ ＣＥＰ２９０／ＮＰＨＰ６ ｐｅｒｔｕｒｂｓ ｉｔｓ ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ ｗｉｔｈＲＰＧＲ ａｎｄ ｒｅｓｕｌｔｓ ｉｎ ｅａｒｌｙ−ｏｎｓｅｔ ｒｅｔｉｎａｌ ｄｅｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｒｄ１６ ｍｏｕｓｅ」Ｈｕｍ Ｍｏｌ Ｇｅｎｅｔ.２００６ Ｊｕｎ １；１５(１１)：１８４７−５７.Ｅｐｕｂ ２００６ Ａｐｒ ２１）に記載の手順に従って行うことができる。]
[0013] 本発明の目的については、配列番号１（ＭＹＯ７Ａ）および配列番号２（ＣＥＰ２９０）から選択されることが好ましい、ＭＹＯ７ＡもしくはＣＥＰ２９０のコード配列、またはこの遺伝暗号の縮重によって同じアミノ酸配列をコードする配列が、哺乳動物の網膜細胞、特に光受容細胞においてその発現を調節できるプロモーター配列に機能的に連結されている。本発明に従って用いられ得る適切なプロモーターとしては、ＭＹＯ７Ａ配列の転写を制御するためのＣＭＶ（配列番号３）およびＣＢＡ（配列番号４）のプロモーター、ＣＥＰ２９０配列の転写を制御するための、上記のプロモーター、さらにはヒトＲＨＯ（配列番号５）プロモーター、転写促進活性を保持しているそれらのフラグメントおよび変異体が挙げられる。]
[0014] ＡＡＶベクターの構築は、当業者に公知である手順に従いかつ技術を用いて行ってもよい。治療法においてアデノ随伴ウイルスベクターを構築および使用するための理論および実施は、いくつかの科学的刊行物および特許刊行物に説明されている（以下の文献目録が参照により本明細書に援用される：Ｆｌｏｔｔｅ ＴＲ.Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ−ｂａｓｅｄ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｆｏｒ ｉｎｈｅｒｉｔｅｄ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ.Ｐｅｄｉａｔｒ Ｒｅｓ.２００５ Ｄｅｃ；５８(６):１１４３−７；Ｇｏｎｃａｌｖｅｓ ＭＡ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ｆｒｏｍ ｄｅｆｅｃｔｉｖｅ ｖｉｒｕｓ ｔｏ ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ ｖｅｃｔｏｒ，Ｖｉｒｏｌ Ｊ．２００５ Ｍａｙ ６；２：４３；ＳｕｒａｃｅＥＭ，Ａｕｒｉｃｃｈｉｏ Ａ．Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｒｅｔｉｎａｌ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｐｒｏｇ Ｒｅｔｉｎ Ｅｙｅ Ｒｅｓ．２００３ Ｎｏｖ；２２（６）：７０５−１９；Ｍａｎｄｅｌ ＲＪ，ＭａｎｆｒｅｄｓｓｏｎＦＰ，Ｆｏｕｓｔ ＫＤ，Ｒｉｓｉｎｇ Ａ，Ｒｅｉｍｓｎｉｄｅｒ Ｓ，Ｎａｓｈ Ｋ，Ｂｕｒｇｅｒ Ｃ．Ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ ａｓ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ａｇｅｎｔｓ ｔｏ ｔｒｅａｔ ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ． Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００６ Ｍａｒ；１３（３）：４６３−８３）。]
[0015] さらなる態様では、本発明は、眼への投与に適した形態であることが好ましい、ＭＹＯ７Ａコード配列またはＣＥＰ２９０コード配列を発現するＡＡＶベクターを含む医薬組成物に関する。適切な投与形態としては限定するものではないが、注射溶液または懸濁剤、点眼液および眼軟膏剤が挙げられる。好ましい実施形態では、ＡＡＶベクターは網膜下注射によって、例えば、網膜下腔、前房または眼球後方腔における注射によって投与される。好ましくは、ウイルスベクターは網膜下アプローチを介して送達される（Ｂｅｎｎｉｃｅｌｌｉ Ｊら、Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ． ２００８ Ｊａｎ ２２；Ｒｅｖｅｒｓａｌ ｏｆ Ｂｌｉｎｄｎｅｓｓ ｉｎ Ａｎｉｍａｌ Ｍｏｄｅｌｓ ｏｆ Ｌｅｂｅｒ Ｃｏｎｇｅｎｉｔａｌ Ａｍａｕｒｏｓｉｓ Ｕｓｉｎｇ Ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ ＡＡＶ２−ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒに記載のとおり）。]
[0016] 治療法に使用するためのウイルスの用量は、投与経路、疾患の重篤度、患者の全身状態、および他の臨床パラメーターに依存して、個別の基準で決定されるものとする。一般には、適切な投薬量は、眼１つあたり１０9〜１０13ｖｇ（ベクターゲノム）の範囲である。]
[0017] 図面の説明
図１．ｒＡＡＶ２／５はＭＹＯ７Ａ遺伝子を効率的にパッケージする
ＭＹＯ７ＡのｃＤＮＡを含むＡＡＶ血清型の平均力価（１ｍｌあたりのゲノムコピー数）。ＡＡＶゲノムは、ＡＡＶ２のＩＴＲ、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターおよびＭＹＯ７ＡのｃＤＮＡ配列（ｒＡＡＶゲノムサイズ：８．１ｋｂ）を含む。データは平均±標準誤差として示される。ＡＡＶ調製物の数は４つである。標準誤差バーの上の数は、平均力価に相当する。] 図１
[0018] 図２．ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＭＹＯ７およびｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＣＥＰ２９０のゲノム完全性
ｒＡＡＶのラージプレップ（ｌａｒｇｅ ｐｒｅｐ）（２．５×１０10ＧＣ／レーン）から直接単離され、アルカリアガロースゲルで分離されるベクターＤＮＡのサザンブロット分析。レーン１および２：ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＭＹＯ７Ａから単離されるゲノム；レーン３および４：ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＣＥＰ２９０から単離されるゲノム。レーン１および３中のサンプルをＤｎａｓｅ Ｉで処理した。] 図２
[0019] 図３．ｒＡＡＶ２／５送達後のＭＹＯ７Ａの発現
Ｃｏｓ７細胞由来の溶解物の抗ＭＹＯ７Ａ抗体を用いたウエスタンブロット分析。この細胞にｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＭＹＯ７Ａ（レーン１）またはｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（レーン２）を形質導入した。対照の網膜由来の溶解物はレーン３に入れる。分子量は左側に示す。ロードしたタンパク質の量（マイクログラム、μｇ）は各々のレーンの下に示す。] 図３
[0020] 実験セクション
方法
プラスミド構築物の生成
ＭＹＯ７ＡをコードするｒＡＡＶの産生のために、ｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＭＹＯ７Ａを以下のように構築した。ヒトＭＹＯ７ＡｃＤＮＡ（ＵＴＲ領域なしのＭＹＯ７Ａコード配列からなる６，６４８ｂｐ）をｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドの中に、ＮｏｔＩ部位とＳａｃＩＩ部位との間にクローニングした（完全ｒＡＡＶゲノムのサイズ：８，１０７ｂｐ）。この目的のために、ＭＹＯ７Ａコード配列（Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ＿０００２６０）を、それぞれ２，８５３ｂｐ、２，２７５ｂｐおよび１，８９０ｂｐの３つのフラグメントに分け、以下のオリゴを用いてヒト網膜のｃＤＮＡ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）からＰＣＲによって増幅した：Ｆ１（ＮｏｔＩ）：ＡＴＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＡＴＧＧＴＧＡＴＴＣＴＴＣＡＧＣＡＧＧＧＧ；Ｒ１：ＣＣＣＣＡＧＧＡＡＧＣＣＡＡＡＣＡＴＣＴ；Ｆ２：ＡＧＧＧＣＴＧＡＧＴＡＴＣＴＧＴＧＧ；Ｒ２：ＣＧＧＧＧＴＴＧＧＧＧＴＴＡＴＣＣＴ；Ｆ３：ＧＣＴＧＡＧＧＡＣＡＴＴＣＧＴＧＡＣ；Ｒ３（ＳａｃＩＩ）：ＴＣＣＣＣＧＣＧＧＴＣＡＣＴＴＧＣＣＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧ。次いで、Ｆ１、Ｆ２およびＦ３と名付けた３つのフラグメントを別々にｐＺｅｒｏ Ｂｌｕｎｔ Ｖｅｃｔｏｒ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）中にクローニングし、配列決定し、次いでｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＥＧＦＰの中での三重連結反応によってクローニングした。ＣＥＰ２９０をコードするｒＡＡＶの産生のために、ｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＣＥＰ２９０プラスミドを以下のように産生した。ヒトＣＥＰ２９０のｃＤＮＡ（ＣＥＰ２９０コード配列、Ｇｅｎｅｂａｎｋアクセッション番号：ＮＭ０２５１１４からなる７，４４０ｂｐ）をヒト骨肉腫細胞株（Ｕ２ＯＳ）ｃＤＮＡからＰＣＲ増幅し、次いでｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＥＧＦＰプラスミドの中でＮｏｔＩ部位とＳａｃＩＩ部位との間でクローニングした（完全ｒＡＡＶゲノムのサイズ：８，９００ｂｐ）。]
[0021] ｒＡＡＶベクターの産生
ｒＡＡＶベクターのラージプレップをＴＩＧＥＭＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒ Ｃｏｒｅによって、ｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ、ｐＡＡＶ２．１−ＣＭＶ−ＣＥＰ２９０、ｐＡＡＶ−ＣＭＶ−ＭＹＯ７Ａを用いて作製した。ｒＡＡＶ２／１、２、３、４、５、７、８および９のウイルスを、２９３細胞の三重トランスフェクションによって、続いて２回のＣｓＣｌ２精製によって作製した（２４）。各々のウイルス調製のためには、物理的力価［ゲノムコピー数（ＧＣ）／ｍｌ］をドットブロット分析により（４３）およびＴａｑＭａｎ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、４２）を用いるＰＣＲ定量により、ＴＩＧＥＭ ＡＡＶ Ｖｅｃｔｏｒによって決定した。各々のラージプレップについて、力価は、ドットブロットおよびＴａｑＭａｎ ＰＣＲ定量分析から平均した。]
[0022] ｒＡＡＶベクターＤＮＡのサザンブロット分析
ＤＮＡは、２，５×１０10個のウイルス粒子（ゲノムコピー数として測定）から抽出した。パッケージされていないゲノムを消化するために、５０ｍＭのＴｒｉｓ ｐＨ７．５および１ｍＭのＭｇＣｌ2を含有する２５０μｌの総容積中でベクターの溶液を１１μｌのＤＮａｓｅ（Ｒｏｃｈｅ）とともに３７℃で１時間インキュベートした。次いでＤＮａｓｅを５０ｍＭのＥＤＴＡを用いて不活性化し、続いて５０℃で４５分間プロテイナーゼＫおよび２．５％のＮ−ラウリル−サルコシル溶液とともにインキュベートしてカプシドを溶解した。ＤＮＡをフェノール−クロロホルムを用いて２回抽出し、２容積のエタノールおよび１０％の酢酸ナトリウム３Ｍを用いて沈殿した。アルカリアガロースゲル電気泳動を以前に記載されたとおり行った（Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｊ．ａ．Ｄ．Ｗ．Ｒ．２００１．Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ：ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ．Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ）。]
[0023] Ｃｏｓ７細胞のｒＡＡＶ感染
Ｃｏｓ７細胞は、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＭＹＯ７ＡまたはｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（１細胞あたり１０4個のＧＣ）のいずれかで感染させた。感染されたＲＰＥ細胞を、感染後７日または１７日のいずれかでウエスタンブロットによってＭＹＯ７Ａ発現がアッセイされるまで培養物中で維持した。]
[0024] ウエスタンブロットによるＭＹＯ７Ａ発現の分析
ウエスタンブロットは、ｒＡＡＶで感染されたＣｏｓ７細胞で行った。サンプルを、氷上で３０分間、ＳＩＥ緩衝液［２５０ｍＭのスクロース、３ｍＭのイミダゾール（ｐＨ７．４）、１％のエタノールおよび１％のＮＰ−４０］の中で溶解し、タンパク質を、８Ｍ尿素を含むサンプル緩衝液中で３７℃で３０分間加熱することによって変性し、６％のＳＤＳ−ＰＡＧＥによって分離した。ブロッティング後、特定のタンパク質を抗ＭＹＯ７Ａ抗体で標識した。]
[0025] 結果
ＡＡＶ５カプシドを有するベクターはＭｙｏ７Ａ構築物およびＣＥＰ２９０構築物を効率的にパッケージする。]
[0026] 種々のＡＡＶ血清型が大きいゲノムをパッケージする能力を試験するため、および得られた結果がパッケージされた配列のヌクレオチド組成に依存するか否かを研究するため、ヒトのＭＹＯ７ＡおよびＣＥＰ２９０のｃＤＮＡ配列をサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーターの下流のＡＡＶ２ ＩＴＲとｐｏｌｙＡシグナルの上流との間に別々にクローニングした。得られたｐＡＡＶ−ＣＭＶ−ＭＹＯ７ＡおよびｐＡＡＶ−ＣＭＶ−ＣＥＰ２９０構築物は、ＩＴＲを含んでいるそれぞれ８．１ｋｂおよび８．９ｋｂを含んだ。種々のＡＡＶ血清型がＭＹＯ７Ａ遺伝子を含む大きいゲノムをパッケージする能力を試験したところ、ｒＡＡＶ２／５ベクターが最も効率的であることが見出された（図１）。ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＭＹＯ７Ａの力価は２．５×１０11±８．８×１０10ＧＣ／ｍｌ（ｎ＝４）であった。同様に、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＣＥＰ２９０のラージプレップの力価は５．１×１０11ＧＣ／ｍｌ（ｎ＝２）であった。] 図１
[0027] ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＭＹＯ７ＡおよびｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＣＥＰ２９０がその全体の長さにそれらのゲノムをパッケージすることを実証するために、ウイルスＤＮＡを各々のベクターの２．５×１０10個の粒子から抽出し、アルカリアガロースゲルでの分離後、サザンブロットによって分析した。予想される分子量のＤＮＡｓｅ耐性バンド（ＣＥＰ２９０については８．９ｋｂおよび−ＭＹＯ７Ａについては８．１ｋｂ）が観察された（図２）。] 図２
実施例

[0028] 大きい遺伝子をパッケージするｒＡＡＶ２／５ベクターでの効率的なインビトロおよびインビボの形質導入
本発明者らは、ＡＡＶを介したＣｏｓ７細胞への形質導入後、ＭＹＯ７Ａ発現レベルを評価した。ＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＭＹＯ７Ａを介した形質導入の結果として、インビトロで効率的な発現が生じる。Ｃｏｓ７細胞にはｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＭＹＯ７ＡまたはｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰ（１０4ＧＣ／細胞、図３）のいずれかが形質導入された。抗ＭＹＯ７Ａ抗体を用いるウエスタンブロット分析によって、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＭＹＯ７Ａ（陽性対照として入れられた野生型網膜と同様）で感染された細胞でのみ２５０ｋＤａのＭＹＯ７Ａのバンドの発現が示されるが、ｒＡＡＶ２／５−ＣＭＶ−ＥＧＦＰで感染された細胞では示されない。] 図３

权利要求:

請求項1
ＭＹＯ７Ａ遺伝子またはＣＥＰ２９０遺伝子の変異に関連する疾患に罹患した哺乳動物対象における網膜の異常および／または網膜の機能不全の治療に使用するための、ＡＡＶ５カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターであって、機能的なＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質をコードする核酸分子を含む発現カセットを担持し、該核酸分子は哺乳動物の網膜細胞においてその発現を調節できるプロモーター配列に機能的に連結されている、組換えベクター。
請求項2
最大９ｋｂの核酸をパッケージすることができるＡＡＶ２／５ベクターである、請求項１に記載の組換えベクター。
請求項3
前記ＭＹＯ７Ａをコードする核酸分子が、配列番号１または配列番号１と同じアミノ酸配列をコードする配列からなる、請求項１に記載の組換えベクター。
請求項4
前記ＣＥＰ２９０をコードする核酸分子が、配列番号２または配列番号２と同じアミノ酸配列をコードする配列からなる、請求項１に記載の組換えベクター。
請求項5
前記プロモーター配列が、転写プロモーター活性を保持する配列番号３、配列番号４、および配列番号５のフラグメントまたはその変異体から選択される、請求項１に記載の組換えベクター。
請求項6
前記治療が、ＣＥＰ２９０をコードするベクターを光受容細胞に形質導入し、ＭＹＯ７Ａをコードするベクターを光受容細胞および網膜色素上皮細胞に形質導入することを包含し、それによりＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質の発現が該細胞内で誘導される、ＭＹＯ７Ａ遺伝子またはＣＥＰ２９０遺伝子の変異に関連する疾患に罹患した哺乳動物対象における網膜の異常および／または網膜の機能不全の治療に使用するための請求項１から５に記載の組換えベクター。
請求項7
ＩＢ型アッシャー症候群およびレーバー先天性黒内障から選択される、ＭＹＯ７Ａ遺伝子またはＣＥＰ２９０遺伝子の変異に関連する疾患に罹患したヒト対象における網膜の異常および／または網膜の機能不全の治療に使用するための、請求項１から６に記載の組換えベクター。
請求項8
請求項１から７に記載のＡＡＶベクターを、眼への投与に適した形態で含む医薬製剤。
請求項9
注射溶液の形態である、請求項８に記載の医薬組成物。
請求項10
ＭＹＯ７Ａ遺伝子またはＣＥＰ２９０遺伝子の変異に関連する疾患に罹患した哺乳動物対象における網膜の異常および／または網膜の機能を改善するための方法であって、１）組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターにＡＡＶ５カプシドを提供する工程であって、該ベクターは、機能的なＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質をコードする核酸分子を含む発現カセットを担持し、該核酸分子は、その転写および翻訳を指示する調節制御エレメントに作動可能に連結されている、工程と、２）ＣＥＰ２９０をコードするベクターを光受容細胞に形質導入し、ＭＹＯ７Ａをコードするベクターを光受容細胞および網膜色素上皮細胞に形質導入することにより、該細胞内でＭＹＯ７Ａタンパク質またはＣＥＰ２９０タンパク質の発現を誘導する工程とを包含する、方法。
請求項11
前記対象がヒトである、請求項１０に記載の方法。
請求項12
前記疾患がＩＢ型アッシャー症候群およびレーバー先天性黒内障から選択される、請求項１０に記載の方法。
請求項13
前記ＡＡＶ５カプシドを有するベクターが、最大９ｋｂの核酸をパッケージすることができる、請求項１０に記載の方法。
請求項14
前記ベクターがＡＡＶ２／５である、請求項１３に記載の方法。
請求項15
前記ＡＡＶ５カプシドを有する組換えアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）ベクターが発現カセットを担持し、ＭＹＯ７ＡまたはＣＥＰ２９０のコード配列が、哺乳動物の網膜細胞においてその発現を調節できるプロモーター配列に対して機能的に連結されている、請求項１０に記載の方法。
請求項16
前記ＭＹＯ７Ａのコード配列が、配列番号１または配列番号１と同じアミノ酸配列をコードする配列からなる、請求項１５に記載の方法。
請求項17
前記ＣＥＰ２９０のコード配列が、配列番号２または配列番号２と同じアミノ酸配列をコードする配列からなる、請求項１５に記載の方法。
請求項18
前記プロモーター配列が、転写プロモーター活性を保持する配列番号３、配列番号４および配列番号５のフラグメントまたはその変異体から選択される、請求項１５に記載の方法。
請求項19
網膜色素上皮細胞および光受容細胞への形質導入が、前記ベクターまたはその医薬製剤の網膜下投与によって達成される、請求項１に記載の方法。